EL CÓDIGO DE BARRAS DE LA VIDA COMO UNA HERRAMIENTA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LARVAS DE PECES


labrisomidos.jpg

Saludos cordiales amigos de Steemit, comunidad de @SteemStem, @Stem-espanol, @utopian-io, @curie. Para complementar la publicación anterior sobre estadios tempranos de peces, aquí les traigo cómo utilizar el código de barras del ADN para identificar las larvas. Para ello, voy a destacar a manera de ejemplo el caso de la familia Labrisomidae y el uso de secuencias del gen que codifica para la enzima Citocromo Oxidasa I (COI) como marcador.  


INTRODUCCIÓN

El empleo de marcadores moleculares para la determinación de larvas de peces, implica la necesidad de un adulto claramente identificado con el cual comparar. De esta manera, pierden efectividad para evaluar un lote de larvas capturado directamente en el campo si no hay un adulto con una apropiada determinación taxonómica sobre el cual se haya empleado el mismo marcador, por lo que en algunas de ellas sólo se podrá llegar morfológicamente hasta familia. Esta problemática no se presenta sólo con larvas, sino también para la identificación de material biológico en general. Por ejemplo, para la determinación de la identidad de fragmentos de organismos, certificación de origen de productos alimenticios ya procesados o crudos, restos óseos y cualquier material biológico que amerite conocerse su determinación específica. En este sentido, la multiplicidad de opciones moleculares desarrolladas en los últimos años (Avise, 2004), complica la posibilidad de tener una base de datos amplia que sirva como herramienta para la identificación de especies. 

Frenente a tal problemática, Hebert et al. (2003) compararon secuencias del gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI), con el objeto de utilizarlo como una herramienta global de identificación dentro del reino animal. Para ello analizaron, en primera instancia, las secuencias COI de 100 especies representativas de los fila más diversos dentro de Animalia. Posteriormente, examinaron 100 individuos de la clase Hexapoda, que representa la más grande concentración de diversidad en el planeta de acuerdo con Novotny et al. (2002) y, por último, construyeron un perfil COI para 200 especies cercanamente relacionadas de lepidópteros. Con las secuencias obtenidas, Hebert et al. (2003) lograron separar con éxito los taxones evaluados en todas las categorías taxonómicas y concluyeron que una base de datos con secuencias COI, pudiera servir para el establecimiento de un sistema de identificación global para ales.

La cLa consolidación del proyecto para una base de datos que permita identificar las especies animales del planeta se ve plasmada en la construcción de http://www.boldsystems.org/views/login.php. El Sistema de Datos para el Código de Barras de la Vida (BOLD Systems) es una herramienta informática que permite la adquisición, almacenamiento y publicación de secuencias correspondientes a regiones del código de barras (barcode) de ADN. De esta manera, se tiende un puente bioinformático que brinda servicios especializados a investigadores del área, agrupando datos moleculares, morfológicos y de distribución para cada taxa (Ratnasingham y Hebe07).

La i">La inclusión de Venezuela dentro de la iniciativa BOLD constituye un aporte significativo debido a su ubicación geográfica, que incluye una plataforma continental en el Caribe, con un complejo insular oceánico y un conjunto de islas costeras, así como una plataforma atlántica influenciada por descargas de grandes ríos. En tal sentido, se aportan secuencias del gen COI a partir de ejemplares venezolanos, que sirvan para enriquecer la base de datos de BOLD Systems y que contribuyan en la gran tarea mundial de una Base de datos para la Vida eneta.
METODOLOGÍA
Se em;">Se escogieron seis estaciones en zonas del archipiélago Las Caracas, Parque Nacional Mochima, Venezuela, y en áreas adyacentes (Fig. 1). Cuatro de ellas estuvieron en zonas de arrecifes someros, una en un arrecife más profundo y otra mar afuera, cerca del  borde de la Plataforma Continental. El diseño de las zonas de muestreo implicó características bien diversas con el objeto de colectar la mayor variedad de larvas de peces (Taig. 2).


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Figu1rem;">Figura 1. Localización de las estaciones de muestreo encre, Venezuela.


Tabla 1. Estaciones de muestreo, localización geográfica y principales características de las estaciones.

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Fit-size: 1rem;">Figura 2. Fotografías en las que se destaca la estructura de los fondos de arrecifes sobre los cuales se realizaron muestreos de ictioplancton. A: Arrecifes fundamentalmente rocosos con corales pétreos y octocorales, B: Arrecife fundamentalmente rocoso con corales pétreos, pero con desarrollo estacional de Sargassum sp., C: Arrecife fundamentalmente coralino, sorenoso.

<.

Parasize: 1rem;">Para la recolección de muestras de ictioplancton se hicieron arrastres, entre 0,5 y 3m de profundidad, utilizando una red estándar para captura de ictioplancton (Holden y Raitt, 1975; Boltowskoy, 1999), con un diámetro de boca de 62cm y 500µm de abertura de malla. Los arrastres se efectuaron a una velocidad promedio de 2 nudos, durante 15 minutos en cada una de las estaciones. La red estuvo equipada con un  medidor de flujo para estandarizar los datos de abu(Fig. 3). 



Muestreo.jpg

Figut-size: 1rem;">Figura 3. Fotografías del método de muestreo utilizado y del ancton.


El Aont-size: 1rem;">El ADN de las larvas se aisló a partir de cada espécimen completo obtenido de los arrastres durante el muestreo de  plancton, mediante el empleo del Kit “NucPrep™ Chemistry Isolation” (Applied Biosystems, Inc.), siguiendo un procedimiento previo de digestión, para luego pasar a las fases de prefiltración, purificación y elución, empleando el equipo “ABI PRISM™ 6100 Nucleic Acid PrepStatio Inc.).

< Inc.).

Debi"font-size: 1rem;">Debido a la heterogeneidad taxonómica del material biológico analizado, para la amplificación por PCR (Polimerasa Chain Reaction) se utilizaron los juegos de cebadores LCO/HCO (5ˈ-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3ˈ/ 5ˈ-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA ATC A-3ˈ) (Folmer et al., 1994), COIeF/COIeR (ATA ATG ATA GGA GGR TTT GG / GCT CGT GTR TCT ACR TCC AT) (Arndt et al., 1996) y diversas combinaciones: COIeF/HCO, LCO/COIeR, COX1F/HCO, COX1F/COIeR (Fig. 4). Estos cebadores son necesarios para que la enzima ADN polimerasa del ADN. 

![pre="font-size: 1rem;">primers.jpg

Fiyle="font-size: 1rem;">Figura 4. Posición relativa de los diferentes cebadores empleados en la amplificacióen COI.

< gen COI.

Los e="font-size: 1rem;">Los productos de las reacciones de PCR fueron enzimáticamente purificados para remover restos de cebadores y de dNTPs no consumidos durante la PCR. Luego, la reacción de secuenciación se llevó a cabo empleando el kit de secuenciación BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc.). Los productos de secuenciación fueron separados y detectados en un equipo ABI PRISM 377-XL. Los electroferogramas obtenidos fueron revisados mediante el programa BioEdit (Hall, 2011), a fin de corregir posibles erroresig. 5).

<; (Fig. 5).

fy; ">![style="font-size: 1rem;">electroferogramas.jpg

Figuyle="font-size: 1rem;">Figura 5. Revisión de los electroferogramas para corregiuencias


; ">

En ustyle="font-size: 1rem;">En un primer paso, la posición taxonómica tentativa de las muestras fue inferida comparando la secuencia problema con las bases de datos GenBank y de la iniciativa BOLD, a través de las aplicaciones respectivas: BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y BOLD-IDS (http://www.boldsystems.org/views/idrequest.php). Esta ubicación taxonómica tentativa obtenida para cada muestra, permite su alineamiento con datos homólogos de taxones co-familiares, utilizando para ello tanto secuencias propias como aquellas disponibles en ig. 6).



<;>Alineamientos.jpg

Figun style="font-size: 1rem;">Figura 6. Captura de pantalla de uno de los alogenéticos.


; ">

Los pan style="font-size: 1rem;">Los alineamientos fueron hechos con el programa MEGA versión 5 (Tamura et al., 2011), el cual fue empleado igualmente para las inferencias filogenéticas. Considerando que el objetivo de este trabajo no es inferir relaciones filogenéticas robustas sino ubicar sistemáticamente ejemplares con base en secuencias del gen COI, se asumió para todas las familias el modelo Kimura 2-Parametrós (Kimura, 1980) para la construcción de los árboles. Ello permite una uniformidad metodológica respecto a las estimaciones de BOLD, que usan este mismo modelo. La obtención de las topologías, mostrando las relaciones filogenéticas y la inclusión de las muestras problema monofiléticamente en un clado, fue llevada a cabo mediante el método de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987). Se realizó un test bootstrap de 2000 réplicas y cercano a cada rama del árbol se muestra el porcentaje de árboles (réplicas) en los cuales los taxonn, 1985). 

A peA pesar de que buena parte de los lectores seguramente no se encuentran familiarizados con esta terminología, se colocó la información técnica metodológica, a fin de queso de ella.



RESULTADOS; ">

Las ">Las secuencias del gen COI permitieron la identificación molecular de 45 especies de larvas de peces. Un número de 14 ejemplares de larvas sólo se pudieron ubicar en el nivel taxonómico de género, basándose en las secuencias COI obtenidas y las disponibles para comparación. La determinación a nivel de familia fue obtenida para 1 larva. Un número de 35 especies de larvas (75%), constituyeron nuevos aportes al conocimiento del desarrollo larvario de alguna especie, haciendo aportes fundamentales en tallas que van desde 1,5mm a 6,8mm, las cuales incluyen a larvas de muy peq conocidas.

Por ; ">Por razones de espacio, en esta publicación muestro el aporte del código de barras en la identificación larvaria de ejemplares de la familia Labrisomidae. Los labrisómidos son un grupo de peces dentro del orden Perciformes, abundantes en aguas tropicales de los oceános Pacífico y Atlántico, con aletas dorsales grandes las cuales poseen mayor cantidad de espina 1994).

![Fo/p>Foto 20-12-18 8 33 18 a. m..jpg

Figufy; ">Figura 7. Fotografía de un ejemplar de Labrisomus nuchipinnis, en un arrecezuela.

Paratify; ">Para esta familia, fueron obtenidas secuencias COI a partir de 8 larvas, las cuales permitieron su asignación específica: 176L de Labrisomus kalisherae (Fig. 8); 374L (Fig. 9A), 459L (Fig. 9B), 474L (Fig. 9C), 621L (Fig. 9D), 762L (Fig. 9E) de Malacoctenus triangulatus. Todas estas secuencias fueron logradas a partir de amplificaciones empleando los primers LCO:HCO. El juego de datos para la elaboración del árbol contuvo 66 secuencias con un total de 417 posiciones. Varias secuencias utilizadas corresponden a la colección de referencia de Benjamin Victor, elaborada a partir de adultos morfológicamente caracterizados. El árbol filogenético, con la ubicación de los ejemplares larvarios dentro deura 10.

< se presenta en la Figura 10; ">

![Lkustify; ">Lkalisherae.jpg&fy; ">Fin: justify; ">Figura 8. Ejemplar de Labrisomus kalisherae, 176L, 4,3 ADN. 

![ma justify; ">malacoctenus.jpg

Figun: justify; ">Figura 9. Ejemplares de Malacoctenus triangulatus identificados por código de barras de ADN. A = 374L, 2,84mm LT. B = 459L, 4,40mm LT. C 5mm LT.

![Árspan>

Árbol.jpg, por lo que es probable que en trabajos previos estos peces hayan quedado dentro del grupo de larvas no identificadas o hayan sido objeto de determinaciones taxonómicas erróneas. Obviamente, los errores previos de identificación de larvas pertenecientes a esta familia sspecto.

![fa

familias.jpg Early stages of Atlantic fishes: an identification guide for westera, USA.

Saext-align: justify; ">Saitou N. y M. Nei .1987. The neighbor-joining method: A new method for r06-425.

Taext-align: justify; ">Tamura K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei y S. Kumar. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution (submitet>.

![Im;.

Imagen2.jpg

TOext-align: justify; ">TODAS LAS IMÁGENES PUBLICADAS SON DE MI AUTORES.
< RESERVAr>



CIALES.





Comments 12


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14.07.2019 00:07
0

¡Felicitaciones!


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Puedes consultar el reporte diario de curación visitando @entropia.

Atentamente

El equipo de curación del PROYECTO ENTROPÍA

14.07.2019 08:33
3

Muchas gracias por su apoyo.

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14.07.2019 09:15
0

CURADORES-01.gif

14.07.2019 09:27
1

Mil gracias por apoyarme!

Posted using Partiko iOS

14.07.2019 21:29
0

Extraordinaria su publicación @afarina46, un trabajo que se deja leer con facilidad a pesar de no manejar el lenguaje técnico de ustedes los especialistas. Quedo complacida por este trabajo impecable. Gracias por la información. Va mi humilde apoyo, saludos.

14.07.2019 21:31
1

Agradezco muchísimo sus comentarios. Su aporte es muy importante para mi.

Posted using Partiko iOS

14.07.2019 21:58
0




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16.07.2019 03:22
1

Thanks for the support!!

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16.07.2019 12:07
0

Hi @afarina46!

Your post was upvoted by Utopian.io in cooperation with @steemstem - supporting knowledge, innovation and technological advancement on the Steem Blockchain.

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16.07.2019 13:53
1

Thank you very much for your support, they have been very kind !!

16.07.2019 17:06
0